1. 目的与适用范围

  •目的：规范木薯品种对SLCMV的抗性评价方法，精准筛选抗病种质。

  •适用范围：适用于木薯育种品系筛选、引种检疫及农业生产中的品种抗性监测。

2. 试验设计与田间管理

2.1 试验地选择

选择SLCMV高发区作为自然诱发鉴定地。若在非疫区进行人工接种，必须在符合生物安全标准的温室中进行。

2.2 种植方案

  •对照设置：必须设置高度感病品种（如NZ199或当地感病品种）作为阳性对照，设置已知高抗品种作为阴性对照（如TC33或TME3）。

  •重复：每个待测品种建议至少种植3个重复，每个重复不少于10-20株。

  •接种方式：自然感病（依赖田间粉虱传播）或人工嫁接接种。

3. 表型病症鉴定（Phenotypic Scoring）

表型鉴定是评价抗性的直观指标，通常在种植后3、6、9个月进行定期观察。

3.1 评价标准（1-5级评分法）

参照国际热带农业研究所（IITA）通用标准：

3.2 统计指标

  •发病率(%)：(发病株数/总调查株数) × 100%

  •病情指数(DI)：[Σ(各级病株数×相对级值)/(总调查株数×5)]×100

4. 分子检测（PCR鉴定）

由于部分品种可能存在“带毒不显症”（隐性感染）现象，必须结合分子检测。

4.1 样品采集

  •部位：采集植株顶部展开的第3-5片嫩叶。

  •保存：放入自封袋，置于液氮或冰盒带回实验室。长期保存需置-80°C。

4.2 DNA 提取

DNA提取推荐使用改进的CTAB法或专用的植物基因组DNA提取试剂盒。

木薯叶片含有大量多糖多酚，提取时需注意纯度。

4.3 PCR 定性检测步骤

  •检测引物：针对 SLCMV 的外壳蛋白（CP）基因设计特异性引物。

  示例引物： * Forward: 5'-ATGTCGAAGCGACCAGCAGATATA-3'

          ♦Reverse: 5'-CCACATCGTGTCTGGACTCAAACG-3'

• PCR 反应体系（25 μL）：
  • 2 × Master Mix: 12.5 μL
  • 引物 F/R (10 μM): 各 1 μL
  • 模板 DNA: 1 μL
  • ddH₂O: 补至 25 μL
• 反应程序：
  1. 94°C 预变性 5 min；
  2. 94°C 变性 30 s，55°C 退火 30 s，72°C延伸 1 min (35个循环)；
  3. 72°C 终延伸 10 min。

4.4 实时荧光定量PCR检测步骤

  •检测引物：针对 SLCMV 的外壳蛋白（CP）基因或其他病毒基因设计特异性引物。

  •PCR 反应体系（ 20μL ）：

• 2×SYBR Master Mix: 10 μL
• 引物 F/R (10 μM): 各 1 μL
• 模板 DNA: 1 μL
• ddH₂O: 补至 20 μL
• 反应条件：95℃变性 1 min；95℃变性15 s，60℃退火延伸30 s，40-50个循环数；Actin基因作为内参。每个样品三个重复，根据相对Ct值计算所检测病毒基因的相对含量，单个样本中各基因的含量计算公式为：ΔCt=Ct_{（Target gene）}- Ct_（Actin）；特定基因在两个样本中的含量计算公式为：ΔΔCt=ΔCt_{（Sample 1）}-ΔCt_{（Sample 2）}；最终相对含量的计算公式=2^{^—ΔΔCt}。
  • 示例Actin引物： * Forward: 5'-TGATGAGTCTGGTCCATCCA-3'

                                                  ♦Reverse: 5'-CCTCCTACGACCCAATCTCA-3'

4.5 结果判定

  •定性检测结果：通过 1.0% 琼脂糖凝胶电泳观察条带。

• 阳性：在目标位置（如约 700 bp 处）出现清晰条带。
• 阴性：无条带。

  •定量检测结果：病毒相对含量可通过计算病毒靶基因的ΔΔCt值来比较，其中ΔΔCt 值越小，相应的2^—ΔΔCt值越高，即病毒含量越高。

5. 综合评价与抗性定级

结合表型和分子检测结果，将品种划分为四个等级：

1. 免疫 (Immune): 表型 1 级，定性检测阴性，定量未检测到病毒含量。
2. 抗病 (Resistant): 表型 1-2 级，定性检测呈弱阳性或阴性，定量检测病毒含量极显著低于感病品种。
3. 耐病 (Tolerant): 表型 2 级，但定性检测为强阳性（病毒载量高但不显症），定量检测病毒含量很高，与感病品种处于同一数量级。
4. 感病 (Susceptible): 表型 3-5 级，定性检测为强阳性，定量检测病毒含量很高。

6. 生产指导建议

  •推广建议： 仅推荐“免疫”或“高抗”级别的品种进行大规模推广。

  •种茎处理： 对于感病产区，即使是抗病品种，也建议每 3-5 年更新一次无毒脱毒种苗。

  •监测预警： 在生长季节（特别是粉虱高发期），依据此 SOP 每月进行一次田间抽检，发现病株立即拔除并销毁。

温馨提示：在实际操作中，SLCMV可能会与其他病毒（如木薯褐色条斑病毒 CBSV）复合感染，建议在 PCR 检测时增加多重 PCR 筛查，以确保鉴定结果的准确性。

辅助解释：

病情指数（Disease Index, 简称 DI）是植物病理学中一个非常核心的概念。简单来说，它不只告诉你“有多少植株病了”，更重要的是告诉你“它们病得有多重”。

我们可以通过以下三个层面来拆解和理解这个公式：

1. 核心逻辑：从“数量”到“质量”的转化

  •发病率（Incidence）：只看“生病”和“健康”的比例。如果 100 棵树里有 10 棵有症状，发病率就是 10%。但它无法区分这 10 棵树是“轻微感病”还是“快病死了”。

  •病情指数（DI）：将发病率与严重度结合在一起。它是一个加权平均值，能够综合反映一个品种的受害程度。

2. 公式各部分的含义

DI = [Σ(各级病株数 × 相对级值) / (总调查株数 × 5)] × 100

  •分子：Σ(各级病株数 × 相对级值}

这是“总病负荷”。它把不同严重程度的植株按“重量级”加起来。

例如：1 棵 5 级（重病）植株对指数的“贡献”，相当于 5 棵 1 级（轻伤）植株。

  •分母：总调查株数 × 5

这是“理论最大值”。假设你调查的所有木薯全部都达到了最严重的 5 级病症，那么分子和分母就会相等。

  •结果：× 100

将计算结果归一化到 0 到 100 之间的数值，方便不同试验、不同品种之间进行横向对比。

3. 举个例子（实战模拟）

假设你调查了 10 棵木薯：1级 (健康): 5 棵；2级 (轻微): 3 棵；3级 (中度): 1 棵；4级 (严重): 1 棵；5级 (极重): 0 棵

计算过程：

  （1）算分子： (5 ×1) + (3 ×2) + (1 × 3) + (1 ×4) + (0 × 5) = 5 + 6 + 3 + 4 + 0 = 18

  （2）算分母： 10 (总株数) × 5 (最高级) = 50

  （3）算 DI： （18/50）×100 = 36

解读： 该品种在此次鉴定中的病情指数为 36。

4. 为什么分母要乘以 5？

如果你在之前的 SOP 中规定最高级是 9 级（某些国际标准使用 1-9 级），那么分母就必须乘以 9。

分母的作用是建立参照系。乘以最高级值是为了确保当所有植株都最严重时，DI 恰好等于 100。

总结

  •DI 越接近 0：品种近乎免疫。

  •DI 越接近 100：品种极度感病，几乎没有生存能力。

  •在农业生产中：DI 比单纯的发病率更能说明问题。一个品种可能 100% 发病，但如果 DI 只有 10（全是 1 级症状），它可能依然具有生产利用价值（即“耐病品种”）。

 

 

图文来源：育种技术与方法岗 张鹏、马秋香