1.目的与适用范围
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- 目的：规范木薯品种对SLCMV的抗性评价方法，精准筛选抗病种质。
- 适用范围：适用于木薯育种品系筛选、引种检疫及农业生产中的品种抗性监测。
2.试验设计与田间管理
2.1 试验地选择
选择SLCMV高发区作为自然诱发鉴定地。若在非疫区进行人工接种，必须在符合生物安全标准的温室中进行。
2.2 种植方案
- 对照设置：必须设置高度感病品种（如 NZ199或当地感病品种）作为阳性对照，设置已知高抗品种作为阴性对照（如TC33或TME3）。
- 重复：每个待测品种建议至少种植 3 个重复，每个重复不少于 10-20 株。
- 接种方式：自然感病（依赖田间粉虱传播）或人工嫁接接种。
3.表型病症鉴定（Phenotypic Scoring）
表型鉴定是评价抗性的直观指标，通常在种植后 3、6、9 个月进行定期观察。
3.1 评价标准（1-5 级评分法）
参照国际热带农业研究所（IITA）通用标准：
级别 |
症状描述 |
抗性评价 |
| 1级 | 无任何症状，叶片健康，无褪绿或皱缩。 | 免疫/高抗 (HR) |
| 2级 | 叶片出现轻微的褪绿斑点，无皱缩。 | 抗病 (R) |
| 3级 | 明显的马赛克花叶症状，叶片局部扭曲，但不影响植株整体生长。 | 中感 (M) |
| 4级 | 严重的花叶和叶片畸形（如鼠尾状），植株略微矮化。 | 感病 (S) |
| 5级 | 极其严重畸形，叶片极小甚至脱落，植株严重矮化、枯死。 | 高感 (HS) |
3.2 统计指标
- 发病率 (%)：(发病株数/总调查株数) × 100%
- 病情指数 (DI)：[Σ(各级病株数×相对级值)/(总调查株数×5)]×100
4.分子检测（PCR 鉴定）
由于部分品种可能存在“带毒不显症”（隐性感染）现象，必须结合分子检测。
4.1 样品采集
- 部位：采集植株顶部展开的第 3-5 片嫩叶。
- 保存：放入自封袋，置于液氮或冰盒带回实验室。长期保存需置-80°C。
4.2 DNA 提取
DNA提取推荐使用改进的 CTAB 法或专用的植物基因组 DNA 提取试剂盒。
木薯叶片含有大量多糖多酚，提取时需注意纯度。
4.3 PCR 定性检测步骤
- 检测引物：针对 SLCMV 的外壳蛋白（CP）基因设计特异性引物。
- 示例引物：* Forward: 5′-ATGTCGAAGCGACCAGCAGATATA-3′
- Reverse: 5′-CCACATCGTGTCTGGACTCAAACG-3′
- PCR 反应体系（25 μL）：
- 2 ×Master Mix: 12.5 μL
- 引物 F/R (10 μM): 各 1 μL
- 模板 DNA: 1 μL
- ddH2O: 补至 25 μL
- 反应程序：
- 94°C 预变性 5 min；
- 94°C 变性 30 s，55°C 退火 30 s，72°C延伸 1 min (35个循环)；
- 72°C 终延伸 10 min。
4.4 实时荧光定量PCR检测步骤
- 检测引物：针对 SLCMV 的外壳蛋白（CP）基因或其他病毒基因设计特异性引物。
- PCR 反应体系（20μL）：
- 2×SYBR Master Mix: 10μL
- 引物 F/R (10 μM): 各 1 μL
- 模板 DNA: 1 μL
- ddH2O: 补至 20μL
- 反应条件：95℃变性 1 min；95℃变性 15 s，60℃退火延伸 30 s，40-50 个循环数；Actin基因作为内参。每个样品三个重复，根据相对Ct值计算所检测病毒基因的相对含量，单个样本中各基因的含量计算公式为：ΔCt=Ct（Target gene）–Ct（Actin）；特定基因在两个样本中的含量计算公式为：ΔΔCt=ΔCt（Sample 1）–ΔCt（Sample 2）；最终相对含量的计算公式=2^—ΔΔCt。
- 示例Actin引物：* Forward: 5′-TGATGAGTCTGGTCCATCCA-3′
- Reverse: 5′-CCTCCTACGACCCAATCTCA-3′
4.5 结果判定
- 定性检测结果：通过0% 琼脂糖凝胶电泳观察条带。
- 阳性：在目标位置（如约 700 bp 处）出现清晰条带。
- 阴性：无条带。
- 定量检测结果：病毒相对含量可通过计算病毒靶基因的ΔΔCt值来比较，其中ΔΔCt 值越小，相应的2—ΔΔCt值越高，即病毒含量越高。
5.综合评价与抗性定级
结合表型和分子检测结果，将品种划分为四个等级：
- 免疫 (Immune):表型 1 级，定性检测阴性，定量未检测到病毒含量。
- 抗病 (Resistant):表型 1-2 级，定性检测呈弱阳性或阴性，定量检测病毒含量极显著低于感病品种。
- 耐病 (Tolerant):表型 2 级，但定性检测为强阳性（病毒载量高但不显症），定量检测病毒含量很高，与感病品种处于同一数量级。
- 感病 (Susceptible):表型 3-5 级，定性检测为强阳性，定量检测病毒含量很高。
- 生产指导建议
- 推广建议：仅推荐“免疫”或“高抗”级别的品种进行大规模推广。
- 种茎处理：对于感病产区，即使是抗病品种，也建议每 3-5 年更新一次无毒脱毒种苗。
- 监测预警：在生长季节（特别是粉虱高发期），依据此 SOP 每月进行一次田间抽检，发现病株立即拔除并销毁。
温馨提示： 在实际操作中，SLCMV 可能会与其他病毒（如木薯褐色条斑病毒 CBSV）复合感染，建议在 PCR 检测时增加多重 PCR 筛查，以确保鉴定结果的准确性。
执笔人：张鹏、马秋香（育种技术与方法岗）